• 0
Towarzysz Damian

"Domowe" rozmnażanie roślin in vitro czyli cierpienia.....

Question

[Część pierwsza]

....młodego, jeszcze nie biotechnologa

Wszystko zaczęło się jakiś rok temu. Zainspirowani kilkoma książkami i stronami internetowymi postanowiliśmy spróbować zrobić to sami.

Dysponowaliśmy wówczas bardzo skromnym laboratorium w skali mikro.

Nie mieliśmy potrzebnych hormonów, składników do pożywki, pomysłu na sterylne warunki, pojemników do hodowli. Było ciężko, jednak upór i setki powtórzeń sprawiły, że rozwiązaliśmy większość problemów.

Chcieć to móc dlatego zaczynamy nasz instruktaż ponieważ lepiej uczyć się na błędach innych

Co potrzebujemy do rozpoczęcia tej niewątpliwej przyjemności:

-przede wszystkim zapał i samozaparcie bez tego będzie ciężko

- spokojne miejsce gdzie możemy to robić (może być kuchnia ponieważ łatwo jest utrzymać czystość)

- komora z laminarnym przepływem lub cleanbox (można to łatwo zrobić, niżej opiszemy jak)

- odpowiednie medium hodowlane czyli "po ludzku" pożywka zawierająca wszystko co roślina potrzebuje

- hormony roślinne które sprawiają, że roślina albo indukuje kallus albo wytwarza pędy lub korzenie (bardzo trudne do zdobycia ale da się zrobić)

- odpowiednie pojemniki (zaczęliśmy od słoików ale to był poroniony pomysł, lepiej użyć sterylnych pojemników na mocz dostępnych w każdej aptece lub sklepie z zaopatrzeniem medycznym)

- odpowiednie środki do sterylizacji (dosyć łatwo dostępne, można kupić lampę UV ale trzeba uważać bo to troszkę niebezpieczne)

- autoklaw (można zrobić z szybkowaru) lub mikrofalówka do sterylizacji pożywki ostatecznie piekarnik ale szczerze nie polecam jeśli ktoś lubi swoje ręce (z piekarnikiem chodzi o to by wsadzić tam zakręcony słoik z pożywka i włączyć na jakieś 140* na pól godziny, a jak wiadomo taki słoik potrafi wybuchnąć )

- miejsce do hodowli:

a) cieplarka, gdy chcemy indukować kallus lub korzenie

:) growbox (skrzynka z oświetleniem, później wszystko opiszemy dokładniej) gdy chcemy indukować pędy lub hodować i hartować większe rośliny

- coś czym roślinę przeniesiemy na pożywkę w pojemniku czyli kilka pęset i coś do cięcia części roślin (np. skalpel, żyletka)

- no i najważniejsze jakaś roślina którą chcemy rozmnożyć

No to zaczniemy od przygotowania odpowiedniego miejsca do pracy.

Miejsce pracy musi być czyste i spokojne - na czas wykonywania czynności związanych z kulturami in vitro nikt nam nie może chodzić i zawracać głowy. Dużo osób oznacza dużo bakterii i grzybów które są niszczycielami wszystkich kultur in vitro.

post-12-0-92020900-1312375075_thumb.jpg

A oto właśnie pogromca kultur in vitro

Do zakładania kultury potrzebujemy idealnie sterylnych warunków.

Może nam to zapewnić pomieszczenie laminarne z przepływem sterylnego powietrza (już wkrótce umieścimy na forum instruktaż jak to zrobić), lub cleanbox - w którym przepływ powietrza nie zachodzi. Cleanbox to w zasadzie skrzynka, z otworem tylko z jednej strony. Można go wykonać np. z foli i kilku listew, lub rurek. Ważne aby wewnątrz był łatwy do dezynfekcji. Warto zrobić dodatkową warstwę foli, umożliwiającą zamkniecie boxa, podczas pracy można ją np. jak u nas wywinąć na górę.

(przepraszam za jakość zdjęć, niestety były robione telefonem)

post-12-0-18405700-1312375132_thumb.jpg

duży cleeanbox, dzięki któremu mamy fragment czystej, wolnej od kurzu przestrzeni w naszym domowym labie, w nim znajduje się właściwy, mały cleanbox

post-12-0-52306100-1312375174_thumb.jpg

mały cleanbox, to w nim odbywają się wszystkie sterylne operacje

post-12-0-23725600-1312375273_thumb.jpg

a to nasza lampa UV (świetlówka UVC do lampy sterylizującej wodę w akwariach/oczkach wodnych), prowizorycznie zamontowana na statywie :) , niedługo trafi do laminara

A teraz najważniejsze, czyli sterylizacja cleanboxa. (czynność tą będziemy musieli wielokrotnie powtarzać, przed każdą pracą związaną z pożywką, przygotowywaniem fragmentów roślin i umieszczaniem ich w pojemnikach)

Przed każdą operacją wymagającą warunków sterylnych należy przemyć wewnętrzne ścianki (folię) środkiem odkażającym (dobry jest zwykły spirytus, denaturat, można także używać specjalnych środków sterylizujących, np. PERA Safe)

musimy także posiadać spryskiwacz (taki jak do mycia szyb), ze spirytusem i dokładnie przed pracą spryskać całą objętość boxa, zapewni to sterylność powietrza wewnątrz.

Jeśli posiadamy lampę bakteriobójczą (UV) to włączamy ją na jakieś pól godziny przed pracą. (trzeba uważać, aby nie narażać skóry, a przede wszystkim oczu na dłuższe działanie promieni UVC, wystarczy włączyć lampę i wyjść z pomieszczenia, wracając należy lampę szybko wyłączyć, starać się nie patrzeć na włączona, bo psują się i bolą oczy).

[cdn. w następnych postach]

Tym sposobem możemy rozmnożyć każdą roślinę, używaliśmy melisy bo jest łatwo dostępna i jej nie szkoda gdy pleśń wszystko zeżre


[CZĘŚĆ DRUGA] cierpień ciąg dalszy...

POŻYWKA

post-12-0-03741400-1312375848_thumb.jpg A tu składniki do pożywek.

Najlepszą pożywką jest tzw. pożywka MS, jej sklad znajdziemy np. tu:

pozywka MS

Z tym że dla naszych celów musimy dodać jeszcze od 5 do 10g agaru na 1l.(AGAR DODAJEMY DOPIERO NA KOŃCU, PRZED STERYLIZACJĄ POŻYWKI, ponieważ hormony zazwyczaj dodaje się w roztworze wodorotlenku sodu, który niszczy agar)

Im więcej agaru, tym oczywiście pożywka będzie twardsza. W zależności od zastosowania należy dobrać odpowiednią twardość, czyli np. do ukorzeniania bierzemy twardszą pożywkę niż do hodowli kallusa. Ale w zasadzie można zawsze stosować stężenie około 7 - 8 g agaru na 1l, jest takie uniwersalne stężenie (dużo zależy też od agaru jaki posiadamy, może on mieć rożne właściwości żelujące)

Cukru możemy dać 30g na 1l

I oczywiście musimy dodać hormony w odpowiednich stężeniach, w zależności od tego czy chcemy uzyskać kallus, pędy, czy korzenie.

Przed dodaniem agaru musimy ustawić odpowiednie pH, około 6. Dobry byłby tutaj pH-metr, czy też papierki wskaźnikowe o zawężonym zakresie. My niestety nie posiadamy ani jednego ani drugiego:smutny2: i jedziemy na uniwersalnych 0-14 (ważne żeby nie było więcej niż 7 i mniej niż 5, chociaż to zależy od rośliny jaką chcemy rozmnożyć)

Robimy to za pomocą rozcieńczonych roztworów HCl i NaOH, KOH (około 1%) Gdy nie posiadamy HCl to ostatecznie może być kwas cytrynowy, a NaOH jest naprawdę łatwo dostać, nawet w sklepach spożywczych. Nazywa się to soda kaustyczna, soda żrąca, albo porostu kret do rur (ale kret musi być w granulkach, trzeba popatrzyć na etykietę czy zawiera wodorotlenek sodu)

Czyli jeszcze raz:

-Najpierw ustalamy ile chcemy pożywki i przeliczamy z proporcji

-Bierzemy wodę destylowaną

-Odważamy odpowiednie ilości mikro i makroelementów

-Dodajemy odpowiednią ilość hormonów (używa się najczęściej ich roztworów w NaOH, lub w DMSO o stężeniach 1mg/ml lub 10mg/ml wyjątkiem jest tu difenylomocznik którego trzeba dawać nawet około 0,3g na 1l pożywki) odmierzamy je pipetką lub strzykawką

-Dokładnie mieszamy pozywkę, badamy jej pH i dodajemy bardzo powoli, po kropli roztwór kwasu. Po każdej dodanej porcyjce dokladnie mieszamy (ważne) i sprawdzamy pH, aż osiągniemy wartość w okolicy 6.

-Teraz dodajemy cukier, witaminy, aminokwasy i agar (wsypujemy go do wstępnie podgrzanej pożywki, intensywnie mieszając i uważając aby nie sypać po ściankach, gdyż strasznie trudno się taki przylepiony rozpuszcza)

-Na koniec pożywkę zagotowujemy i wkładamy do cleanboxa (jeśli mamy ją w zlewce)

A jeśli posiadamy taką (lub podobną) buteleczkę

post-12-0-90498400-1312375914_thumb.jpg zostawiliśmy w niej pożywkę i już jakiś miesiąc jest sterylna(nie pokazuje się pleśń ani bakterie) więc jest OK, te "kruszki" to nierozpuszczony difenylomocznik, którego przypadkiem daliśmy zbyt dużo, ale mimo to taka pożywka nadaje się do hodowli roślinek

to nalewamy pożywki, wkładamy do mikrofalówki, grzejemy aż się zagotuje, zakręcamy i grzejemy jeszcze kilka sekund (ta butelka jest o tyle fajna że jest specjalnie wykonana do autoklawu, "pancerna" i nie powinna nam wybuchnąć, warto sobie taką kupić, niestety jest dość droga, około 10zl zależnie od wielkości)

Jeśli posiadamy autoklaw to możemy pożyweczkę w tej butli od razu wsadzić zakręconą na jakieś pól godziny.

Do autoklawu możemy też wsadzić pożywkę już rozlaną do pojemniczków, i zostawić potem do ostygnięcia w cleanboxie.

HORMONY i tu zaczynają się schody...

AUKSYNY

Fitohormony odpowiedzialne za ukorzenianie się roślin, oraz dominację wierzchołkową. Syntetyzowane są w stożku wzrostu roślin. Blokują rozwój pędów bocznych.

Przykładowe auksyny:

- IAA kwas indolo-3-octowy

- IBA kwas indolo-3-masłowy

- NAA kwas naftylooctowy

- PAA kwas fenylooctowy

- 2,4-D kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy (najsilniejsza auksyna, używana zazwyczaj do indukcji kallusa)

My posiadamy NAA, PAA i 2,4-D czekający na oczyszczanie (strasznie śmierdzi, gdyż syntezowaliśmy go z 2,4-dichlorofenolu)

Kwas naftylooctowy i jego roztwór gotowy do użytku (10mg/1ml NAA w 1N NaOH)

CYTOKININY

Fitohormony odpowiedzialne za rozwój pędów bocznych, powoduje przyśpieszenie namnażania się komórek roślin, zapewnia "długowieczność" roślin.

Przykładowe cytokininy:

pochodne adeniny:

- Kinetyna KIN

- Zeatyna

- Benzyloaminopuryna BAP

pochodne mocznika:

- Tidiazuron TDZ

- Difenylomocznik DPU

Nam udało się zsyntetyzować właśnie difenylomocznik.Uwagi dotyczące opisu związku.doc

Na początku próbowaliśmy "wyciągnąć" auksyny z ukorzeniacza, ale to było bardzo męczące, ponieważ nie znaliśmy stężenia. Przepłukiwaliśmy (ekstrahowaliśmy) ukorzeniacz rozpuszczalnikiem (np. acetonem, eterem itp.), po odparowaniu hormon nam wykrystalizował, ale były to ilości rzędu 0,01g (wówczas nie możliwe dla nas do zważenia) a koszt ukorzeniacza + zuzyte rozpuszczalniki + stracone nerwy sprawiły ze zaniechaliśmy tej karkołomnej metody i porwaliśmy na samodzielne tworzenie hormonów.

Ale to już inna historia...

[cdn. w następnych postach]

[część trzecia]

Historii ciąg dalszy:

Po długich zmaganiach z brakiem odpowiednich hormonów w końcu mamy wszystko co jest potrzebne czyli 6-benzyloaminopurynę i kwas 1-naftylooctowy.

No i mamy już komorę laminarną.

(wątek w dziale "Moje laboratorium")

A teraz przejdźmy do opisu przygotowywania eksplantów (fragmentów roślin, które mają zostać wprowadzone do kultury in vitro)

Po pierwsze musimy wybrać sobie jakąś roślinę.

Ucinamy fragment rośliny najlepiej kolonko lub wierzchołek wzrostu (są to merystemy czyli miejsca w których komórki rośliny intensywnie się dzielą, odpowiednio dla kolanka jest to merystem interkalarny a dla wierzchołka - wierzchołkowy). Oczywiście dzięki zastosowaniu hormonów możemy pobrać dowolną tkankę rośliny, ale merystemy będą szybciej rosły.

Ale zanim przejdziemy dalej musimy przygotować sobie miejsce pracy:

W przypadku cleanboxa musimy przetrzeć jego wewnętrzne powierzchnie szmatką ze spirytusem i spryskać nim całą jego objętość.

W przypadku laminara trzeba włączyć nadmuch, przetrzeć blat roboczy spirytusem, ewentualnie można przetrzeć ścianki boczne. Warto zostawić przed pracą włączony nadmuch i lampę UV na jakieś pół godziny.

Teraz bierzemy nasze fragmenty rośliny (nie powinny być zbyt duże, i tak potem musimy powycinać małe fragmenty) i sterylizujemy je. My w tym celu przygotowujemy trzy roztwory :

-podchloryn sodu (wybielacz ACE z wodą destylowaną w stosunku 1:10, możemy też dodać tu kropelkę detergentu np. płynu do naczyń)

-nadtlenek wodoru (perhydrol z wodą dest., 1:2, ale od biedy można użyć nawet wody utlenionej, tylko trzeba wtedy dłużej moczyć)

-spirytus 70% (lepiej żeby to nie był denaturat ze względu na środek skażający, spiryt po prostu rozcieńczamy na oko tak aby miał około 70% - czyli mniej więcej 3:1 alkohol z wodą dest.)

I musimy przygotować sobie też sterylną wodę (my gotujemy destylowankę w mikrofalówce).

Oczywiście nie musimy używać wszędzie wody destylowanej, ale jest to wskazane szczególnie gdy ktoś ma twardą wodę.

Przygotowujemy sobie pojemniki z roztworami (zlewki/słoiki/itp.).

Najpierw maczamy fragmenty roślin przez jakieś 20-30minut w roztworze ACE, czynność tę możemy wykonać poza laminarem/cleanboxem.

(my maczamy w takiej kolejności, zapewne można w innej i w innych środkach, ale dobrze by było żeby spirytus był na końcu)

Warto co jakiś czas zamieszać podczas każdego moczenia.

post-12-0-17209800-1312376712_thumb.jpg - tutaj widać roślinki (mięta, pelargonia i jakaś orchidea noname) i roztwory środków odkażających

W tym czasie możemy przygotować sobie pojemniki z pożywką (tę operację musimy wykonać w warunkach sterylnych).

Musimy mieć w tym momencie już przygotowane sterylne warunki.

Przygotowujemy sobie sterylne pojemniki (najfajniej mieć kupne sterylne pojemniki np. na mocz i od razu wsadzić je laminara).

Możemy użyć też słoików, czy jakiś plastikowych pojemniczków z zakrętkami (ważne żeby dało się je szczelnie zamknąć i żeby wytrzymywały wysoką temperaturę podczas sterylizacji). Pojemniki możemy wyjałowić na kilka sposobów: najlepiej w autoklawie, my robimy to w mikrofalówce, można też w piekarniku. W naszym przypadku nalewamy do nich po troszce wody (3-5mm) i grzejemy jakieś 5min w mikrofalówce (woda musi porządnie wrzeć). Gorące pojemniki przenosimy szybko do warunków sterylnych, możemy je jeszcze spryskać spirytusem.

Bierzmy wrzącą jeszcze pożywkę (najlepiej sterylizować ją w autoklawie w zakręconej butelce) i wstawiamy ją do cleanboxa/laminara, podobnie jak w przypadku pojemników.

My gotujemy pożywkę w zlewce za pomocą mikrofalówki i wrzącą przekładamy do laminara. (para unosząc się znad pożywki blokuje dostęp zanieczyszczeń do niej)

Teraz musimy już ubrać rękawiczki, przetrzeć je spirytusem i ponalewać gorącą pożywkę do pojemników, uważając aby jej nie porozlewać i aby się nie poparzyć. W laminarze wszystko robi się bardzo przyjemnie, a w cleanboxie trzeba wszystko robić bardzo ostrożnie ale też się da (trzeba pilnować by nie wprowadzać ruchu powietrza, nie należy wykonywać gwałtownych ruchów i warto często spryskiwać całość spirytusem, oczywiście nie może się on dostać w zbytnich ilościach do pożywki).

Zostawiamy pożywkę do ostygnięcia (w laminarze dzieje się to szybko ze względu na przedmuch) i jeśli minęło te 20-30 minut wyciągam roślinki z ACE i wkładamy do wody (ostygniętej i w miarę sterylnej, tzn. nie musi ona stygnąć w warunkach absolutnie sterylnych, ale np. powinna być czymś przykryta). Należy trochę zamieszać i przekładamy rośliny do roztworu nadtlenku wodoru na jakieś 10min. Kolejną wodę musimy mieć już całkiem sterylną, tzn po gotowaniu odstawimy ją do ostygnięcia do laminara/cleanboxa.

post-12-0-27713000-1312376671_thumb.jpg - tu pożywka sobie stygnie w laminarze, widać też zlewki z woda i spirytusem, palnik, oraz narzędzia w denaturacie (no i czyste rękawiczki)

Pojemnik z roślinami które moczą się w nadtlenku wodoru przekładamy do warunków sterylnych (warto go przetrzeć z zewnątrz spirytusem).

Musimy mieć znów założone rękawiczki i przetrzeć je spirytusem. Gdy minie około 10 minut wyjmujemy rośliny i wrzucamy je do sterylnej wody. Wyciągamy z wody i kładziemy np. na sterylną szalkę petriego (sterylizujemy tak samo jak słoiczki itp.) Teraz należy pociąć eksplanty na odpowiednie kawałki. robimy to najlepiej za pomocą skalpela, ale może to być żyletka lub w ostateczności jakiś nożyk (ważne żeby ostrze dało się wyjałowić - najpierw nad płomieniem a pózniej trzymamy je np. w spirytusie)

(oczywiście wszędzie gdzie piszemy że wyciągamy/ wkładamy roślinki gdziekolwiek - robimy to za pomocą pęsety

Wycinamy odpowiednie fragmenty (my z reguły tniemy eksplanty na kawałki około 3-5mm). Jeśli mamy np. fragment lodygi z kolankiem i listkami to obcinamy listki, obcinamy łodygę po obu stronach kolanka i teraz możemy zostawić już takie kolanko w całości lub pociąć go na jeszcze drobniejsze fragmenty (w idealnych warunkach kulturę powinno dać się założyć wychodząc nawet od jednej komórki).

Gdy potniemy eksplanty, to maczamy je w spirytusie 70% (my tak robimy, ale można zrobić to także przed cięciem i od razu po cięciu wkładać na pożywkę). Po spirytusie znowu płukanie w sterylnej wodzie i możemy już sadzić nasze roślinki na agarze.

Oczywiście nasza pożywka powinna już być stała, jeśli jeszcze nie ostygła to musimy zaczekać (roślinki powinny być przez ten czas w wodzie)

Roślinki sadzimy za pomocą pęsety, lekko wciskając je w pożywkę, tak aby mniej więcej do polowy z niej wystawały. Uważamy przy tym aby nie dotykać brzegów pojemnika tą częścią pęsety za którą trzymamy (najlepiej mieć długa pęsetę - nawet 20 - 30 cm).

Po wsadzeniu eksplantów na pożywkę zamykamy pojemniki na szczelno. (zakręcamy słoiki, można też zrobić kapturki z foli aluminiowej ale jest to bardzo uciążliwe, ponieważ trudno tę folię oczyścić - można spirytusem ale potem musi wyschnąć i łatwo ją potem uszkodzić)

Gotowe kulturki wkładamy do cieplarki lub do growboxa (fitotronu), w zależności czy zamierzamy aby roślinki rosły w ciemności czy świetle.

A teraz parę zdjęć naszych słoiczków

Roślinki w tych słoiczkach przebywają w cieplarce (w ciemności) w temp. 22-25*C Kultury te zostały założone 27.02.2011

post-12-0-05914500-1312376521_thumb.jpg - tutaj pęd zabawnie rośnie w górę

post-12-0-81153900-1312376551_thumb.jpg - tutaj już zaczyna się tworzyć tkanka kallusowa


post-12-0-38319000-1312376573_thumb.jpg - gotowe pojemniczki z kulturami in vitro jeszcze w laminarze

post-12-0-60245500-1312376602_thumb.jpg - a tu liście mięty na pożywce, powolutku zaczyna rosnąć kallus

Warto dodać jeszcze coś o naszej mikrofalówce - została ona lekko zmodyfikowana, tzn. w normalniej mikrofalówce wentylator chłodzący magnetron wdmuchuje powietrze przez dziurki do przestrzeni w której się podgrzewa produkty, myśmy odwrócili element kierujący powietrze w drugą stronę (powietrze wylatuje od razu na zewnątrz) i zakleiliśmy dziurki, więc nic nam tam nie dmucha i jest praktycznie sterylna wewnątrz (są tylko dziurki, którymi może wylatywać para wodna).

Pozdrawiamy wszystkich

Niedługo (w miarę naszych możliwości) ciąg dalszy.

-1

Share this post


Link to post

59 answers to this question

  • 0

Kiedyś miałem komorę mikrobilogiczną z takiego pudła:

chemia podstawowy 2005.pdf

Z boku śluza w postaci drzwiczek i wstawionego drugiego, mniejszego pudła.

A do dezynfekcji używałem manusanu, izopropanolu albo spirytusu hibitanowego. Była też świetlówka UV 9W do sterylizacji.

Tak czy siak komorę sprzedałem a teraz znowu muszę trochę nad kilkoma mikroorganizmami posiedzieć i chyba będę musiał nową budować.

No ale tak odbiegłem od tematu a zmierzałem do tego, że wg. mnie moje rozwiązanie zapewniało łatwiejsze zachowanie sterylności niż konstrukcje foliowe.

Niemniej post ciekawy (i proponuję administracji, żeby w rozwoju forum szła w kierunku takich tematów).

A jakie rośliny już udało ci się rozmnożyć?

Pozwoliłem sobie zmienić trochę rozmiary zdjęć, poprawiając tym samym strukturę graficzną posta;) /A001d

0

Share this post


Link to post
  • 0

Za niedługo ciąg dalszy, właśnie siedzimy i piszemy. Fajny pomysł z tą skrzynką i rękawiczkami, ale my już kombinujemy z budową laminara, właśnie zamawiamy filtry HEPA. Później opiszemy nasze zmagania z lamianrem, ale myślę że skończymy go najszybciej za miesiąc.

A rośliny hodujemy w zasadzie co popadnie. Rozmnażaliśmy już melisę, ale w probówkach, w pożywce ciekłej.

Pozdrawiamy wszystkich :)

PS:

Mamy nadzieję że nie przestraszyło Was nasze powitanie xD i dość chaotyczny sposób pisania :)

PS2:

Nasza UVka ma 38W

0

Share this post


Link to post
  • 0

A tam, melisa? Melisę to ja rozmnażam od kilku lat z listka lub kawałka gałązki bardzo szybko puszczają korzonki, podobnie np. lawenda, żurawina czy hortensje których 10 doniczek właśnie zimuje w piwnicy :)

proszę pisać bez ortów / Oxygenium

0

Share this post


Link to post
  • 0

Czyli jeszcze raz:

-Najpierw ustalamy ile chcemy pożywki i przeliczamy z proporcji

-Bierzemy wodę destylowaną

-Odważamy odpowiednie ilości mikro i makroelementów

-Dodajemy odpowiednią ilość hormonów (używa się najczęściej ich roztworów w NaOH, lub w DMSO o stężeniach 1mg/ml lub 10mg/ml wyjątkiem jest tu difenylomocznik którego trzeba dawać nawet około 0,3g na 1l pożywki) odmierzamy je pipetką lub strzykawką

-Dokładnie mieszamy pozywkę, badamy jej pH i dodajemy bardzo powoli, po kropli roztwór kwasu. Po każdej dodanej porcyjce dokladnie mieszamy (ważne) i sprawdzamy pH, aż osiągniemy wartość w okolicy 6.

-Teraz dodajemy cukier, agar i witaminy, aminokwasy

-Na koniec pożywkę zagotowujemy i wkładamy do cleanboxa (jeśli mamy ją w zlewce)

0

Share this post


Link to post
  • 0

Przepraszam że tak rzadko piszemy, ale ostatnie weekendy poświęciliśmy na budowę komory laminarnej (zresztą opisaliśmy już w dziale Moje laboratorium).

Gdy już całkowicie skończymy laminara, to zrobimy dokładny opis ze zdjęciami procesu zakładania kultur in vitro.

Fragmenty roślin maczamy w roztworach:

podchlorynu sodu (ACE 1:10 z wodą destylowaną)

woda destylowana

nadtlenku wodoru (około 10%)

woda destylowana

alkohol etylowy (około 70%)

woda destylowana

Zresztą opiszemy to dokładniej za jakiś czas, wraz ze wszystkim innymi czynnościami.

Pozdrawiam

0

Share this post


Link to post
  • 0

No racja troche nie pisaliście. Jestem ciekawy dalszej części.

0

Share this post


Link to post
  • 0

post-12-0-33708100-1312376346_thumb.jpg - gotowe pojemniczki z kulturami in vitro jeszcze w laminarze

post-12-0-36791500-1312376448_thumb.jpg - nasza cieplarka - samoróbka ze styropianu, stereo termostatu i spirali z drutu oporowego (grzałka kuchenki mikrofalowej)

0

Share this post


Link to post
  • 0

Panowie, oprócz niezwykle ciekawej pasji, jaka jest rozmnażanie roslin in vitro, to Wy jeszcze posiadacie talent pisarski (Wasz opis "cierpień" jest bardzo ciekawy) oraz reżyserski, film jest znakomity. Z niecierpliwością czekam na dalszy ciąg!

0

Share this post


Link to post
  • 0

Dzięki za słowa uznania :)

Ogólnie rozmnażanie roślin w ten sposób jest bardzo fajne, szczególnie gdy co tydzień przychodzimy do naszej pracowni i sprawdzamy co dzieje się w naszych pojemniczkach.

Teraz mamy w planie na najbliższe weekendy mały remont w naszym "labie" i budowę fitotronu (szafy z oświetleniem i ogrzewaniem dla naszych roślinek).

Gdy już dobrze opanujemy hodowlę "łatwych" roślin (tych które łatwo się ukorzeniają itp.) weźmiemy się prawdopodobnie za jakieś ciekawsze okazy (może jakieś owadożerne, albo więcej storczyków).

0

Share this post


Link to post
  • 0

weźmiemy się prawdopodobnie za jakieś ciekawsze okazy (może jakieś owadożerne' date=' albo więcej storczyków).[/quote']

świetny pomysł. zamawiam muchołówkę.

0

Share this post


Link to post
  • 0

Temat bardzo ciekawy :) , ale zastanawia mnie to dlaczego wasze kultury nie są zainfekowane. Na filmiku widać jak przenosisz dłonie nad odkażonym materiałem roślinnym.

Podajecie że sterylizacja r-rem wybielacza (zawartość podchlorynu sodu- 5%) wynosi 20-30 min. Oczywiście biorąc pod uwagę rozcieńczenie wychodzi na to że stężenie wynosi ok 0,5% NaClO. Jak dla mnie trochę długo, choć zależy dla jakich roślin, bo np. moje brugmansie nie przezywają 15 min sterylizacji w takim stężeniu.

Jak grzejecie wodę w mikrofalówce to słoiki macie zakręcone czy nie?

0

Share this post


Link to post
  • 0

Tylko pamiętaj kolego że ten materiał roślinny jest jeszcze przed bezpośrednim umieszczeniem w kulturze in vitro, sterylizowany w spirytusie. Poza tym praca w komorze laminarnej sprawia że nie ma szans na zakażenie kultur, chyba że byś pluł do tych roślin.

Co do czasu sterylizacji to po prostu do różnych roślin musisz sam wybrać odpowiedni czas sterylizacji.

A kultur zrobiliśmy już około 60 - 70, a zakażone były tylko trzy. Były to storczyki, których materiał roślinny był pobrany z korzeni. Czyli wyrósł nam symbiotyczny grzyb.

Co do słoików to są otwarte bo woda paruje i zapobiega zakażeniom.

Za jakiś czas wrzucimy od nowa zdjęcia.

Pozdrawiam Towarzysz Damian

0

Share this post


Link to post
  • 0

Jeśli chodzi o sterylizację, to używamy wybielacza rozcieńczonego wodą około 1:10 (Towarzysz Damian nie napisał).

I tak jak kolega napisał roślinki bezpośrednio przed umieszczeniem na pożywce są jeszcze maczane w około 70% etanolu, płukane w sterylnej wodzie destylowanej i dopiero wykładane na pożywkę.

Ale faktem jest że różne rośliny bardzo różnie reagują na sterylizację w podchlorynie. Trzeba eksperymentalnie to sprawdzić.

Aha, chciałbym jeszcze dodać że roztwór wybielacza można zobojętnić małą ilością kwasu do neutralnego pH, gdyż normalnie zawiera on NaOH. Może to też wpłynąć na stan fragmentów roślin po moczeniu.

Pozdrawiam wszystkich

0

Share this post


Link to post
  • 0

ja zamawiam storczyka ;) Chcę się pochwalić, że rozmnożyłem wierzbę. Uciąłem 2 gałęzie włożyłem do ziemi tydzień intensywnego podlewania i teraz mam 3 wierzby. :) Bardzo chętnie mogę komuś wysłać gałązkę.

0

Share this post


Link to post
  • 0

Tak jak obiecaliśmy wrzucamy nowe zdjęcia:

Kalus lawendy

post-12-0-20846800-1314228984_thumb.jpg post-12-0-46976800-1314228990_thumb.jpg

post-12-0-34225900-1314229009_thumb.jpg post-12-0-02262000-1314229027_thumb.jpg

post-12-0-75300100-1314229064_thumb.jpg

Przenoszenie kalusa lawendy na pożywkę z nadmiarem cytokininy aby indukować rozwój pędów:

post-12-0-57044700-1314229175_thumb.jpg post-12-0-10881700-1314229187_thumb.jpg

post-12-0-61809100-1314229202_thumb.jpg

Pędy i kalus melisy w hodowli in vitro:

post-12-0-96647900-1314229404_thumb.jpg post-12-0-68568400-1314229427_thumb.jpg

0

Share this post


Link to post
  • 0

A teraz pokażę jak bardzo wydajna jest taka metoda rozmnażania roślin.

Zaczęliśmy od jednego pojemnika w którym wyrosła grudka kalusa.

post-12-0-38897000-1314233580_thumb.jpgtutaj widzimy pojemnik już po pobraniu kalusa, niestety przed pobraniem nie wykonałem zdjęcia chociaż widzimy rozrzucone po pożywce komórki kalusowe.

Następnie ten kalus podzieliliśmy i przełożyliśmy do trzech pojemników

post-12-0-53038400-1314233738_thumb.jpg post-12-0-33711100-1314233750_thumb.jpg

A po miesiącu wyglądały tak:

post-12-0-84233400-1314233924_thumb.jpg

kalus zwiększył swoją masę kilkakrotnie. Następnie przełożyliśmy go na kolejne pożywki, aby doprowadzić do organogenezy i wykształcić pędy.

post-12-0-32910400-1314233945_thumb.jpg post-12-0-17500200-1314233961_thumb.jpg

post-12-0-56120400-1314233976_thumb.jpg post-12-0-46324800-1314233993_thumb.jpg

Jak więc widzicie z jednego pojemnika na mocz powstało 20 pojemników, w którym znajdują się po 5,6 kupek kalusa.

Jeśli wszystko pójdzie dobrze to otrzymamy więcej niż 100 nowych roślin.

Aby zapewnić roślinom odpowiednie warunki przy organogenezie (w tym wypadku wykształcanie pędów = światło + temperatura) musieliśmy wybudować fitotron. Opis jak go zbudować dodamy w "Moje laboratorium"

post-12-0-54204800-1314234258_thumb.jpg post-12-0-95835700-1314234271_thumb.jpg

post-12-0-22719300-1314234420_thumb.jpg post-12-0-03214500-1314234288_thumb.jpg

0

Share this post


Link to post
  • 0

Otrzymaliście ok. 100 nowych roslinek. Co z nimi robicie? czy po podrośnięciu posadzicie je do doniczek lub ogródka?

0

Share this post


Link to post
  • 0

Otrzymaliście ok. 100 nowych roslinek. Co z nimi robicie? czy po podrośnięciu posadzicie je do doniczek lub ogródka?

Sprzedamy na allegro. A poza tym będą dopiero gotowe gdzieś za około miesiąc.

0

Share this post


Link to post
  • 0

Nowe zdjęcia, przekładanie kalusa pelargonii na nową pożywkę w celu dalszego namnożenia.

Pożywka: MS 100%

Hormony: 1mg/l BAP; 0,5mg/l NAA.

post-12-0-51759700-1314494788_thumb.jpg post-12-0-55203200-1314494794_thumb.jpg

post-12-0-33107100-1314494800_thumb.jpg post-12-0-76764000-1314494843_thumb.jpg

post-12-0-34304800-1314494851_thumb.jpg post-12-0-99454300-1314494859_thumb.jpg

post-12-0-24035800-1314494867_thumb.jpg post-12-0-99371600-1314494876_thumb.jpg

post-12-0-03025000-1314494885_thumb.jpg

Oraz fitotron z włączonym oświetleniem.

post-12-0-66811200-1314494893_thumb.jpg post-12-0-82543300-1314494901_thumb.jpg

post-12-0-94226500-1314494908_thumb.jpg

0

Share this post


Link to post
  • 0

Wczoraj, a właściwie dzisiaj, godzina 02:00 w nocy kolejne kultury in vitro.

Katalpa, pożywka WPM (do roślin zdrewniałych), 1 BAP; 0,5 NAA-stężenia hormonów do wytwarzania kalusa.

post-12-0-84145700-1314622020_thumb.jpg

Oczyszczanie materiału roślinnego: 10% ACE, czas moczenia: 10min. + kilka kropel płynu do mycia naczyń

(aby zmniejszyć napięcie powierzchniowe)

post-12-0-08275100-1314621666_thumb.jpg post-12-0-54872200-1314621680_thumb.jpg

Rozlewanie pożywki do 5-ciu pojemników:

post-12-0-11238600-1314621723_thumb.jpg post-12-0-99352300-1314621764_thumb.jpg

post-12-0-31686600-1314621792_thumb.jpg

Cięcie materiału roślinnego na mniejsze eksplanty:

post-12-0-73367200-1314621828_thumb.jpg post-12-0-93897100-1314621848_thumb.jpg

post-12-0-17524000-1314621877_thumb.jpg post-12-0-45993400-1314621895_thumb.jpg

Umieszczenie eksplantów na pożywkę:

post-12-0-86556800-1314621932_thumb.jpg post-12-0-46761200-1314621949_thumb.jpg

Gotowe pojemniki z kulturami roślin in vitro. Teraz tylko czekać na to, aż pojawi się kalus.

post-12-0-57833200-1314621990_thumb.jpg

0

Share this post


Link to post

Żeby dodać komentarz, musisz założyć konto lub zalogować się

Tylko zarejestrowani użytkownicy mogą dodawać komentarze

Dodaj konto

Załóż nowe konto. To bardzo proste!


Zarejestruj nowe konto

Zaloguj się

Posiadasz już konto? Zaloguj się tutaj.


Zaloguj się teraz